自《馬關條約》后，中華民族與帝國主義之間的矛盾愈演愈烈，不可調和。1900年，八國聯軍發動了侵略中國的戰爭，于8月16日攻陷北京，慈禧太后攜光緒于前一天倉皇逃走，北京再一次落入外國入侵者的手里。圓明園也就是在這一年再一次慘遭洗劫。

1894年，清政府在甲午戰爭中一敗涂地，與新興的日本帝國簽訂了1840年以來對中國政治、經濟、文化、社會生活等方面侵占最為嚴重的《馬關條約》，中國半殖民地化的程度大大加深了。中外矛盾迅速上升為當時中國社會的主要矛盾，在這種局勢下，19世紀的最后五年間，義和團迅速發展，并于1900年控制了京津地區。義和團打出“扶清滅洋”的口號，意在中國大地上驅逐外來勢力，恢復中國原有的社會秩序。在德國公使克林德被清軍擊斃后，各國以保護公使館為名，派兵進入北京，以東江米巷（后來的東交民巷使館區）為中心，與義和團展開了激烈的攻奪戰。為了解救在京被困的西方外交官與教會信眾、各國僑民，英、法、德、俄、奧、意、日、美八國組成聯軍，發動了侵略中國的戰爭。

拆園最烈者為八旗兵

1900年的入侵者比1860年的人數更多而且更為兇殘。他們又一次展開搶掠和縱火，范圍更廣，持續更久。搶掠的地點包括有錢人和滿洲貴族的家，掠奪者不僅僅是軍隊，外交人員與傳教士亦參與其中。

美國傳教士丁韙良在搶掠現場看到，那些掠奪者的爭搶場面只能用“暴動”來形容，許多中國俘虜遭到殘暴的虐待和無情的槍殺。當時一位美國作家感覺“這些中國人遭受的對待就像羅馬暴君尼祿在位時期的基督徒”。具有諷刺意味的是，就在戰爭發動的一年前，這八國列強全都加入了1899年的海牙公約，明文禁止戰時搶奪和恣意殺戮。

這一時期，新建成的頤和園和殘破的圓明園也遭到了摧殘。八國聯軍入京后，董福祥率戰敗的甘軍北逃出京，德國馬步隊追擊董軍直至南口，此時董軍已逃至懷來，德軍追趕不及而返。德軍部隊一部分駐朗潤園，英軍駐頤和園，意軍駐玉泉山。當冬天來臨時，盤踞朗潤園的德國侵略兵，竄到正覺寺拆走大殿的門窗當柴燒，砍壞佛像的鼻子，搶走寺內珍存的大量西藏進貢的錦邊彩畫佛像及青銅梵文大鐘。與1860年的浩劫有著同樣的丑行，入侵者為了分贓而成立了一個獎金委員會，并在英國的使館舉行拍賣會。

但也有專家認為，到目前為止，尚無史料證明八國聯軍曾經進入圓明園進行劫掠，在這一時期真正讓圓明園遭受劫難的是當時清政府駐守西郊的八旗兵、太監以及地痞流氓。據王威所著《圓明園》一書記載：“城外的駐軍與惡霸們活動得更兇，他們乘機大肆洗劫西郊各園的陳設，圓明園也不例外。他們將殿座亭榭及宮門和銅獅等一齊拆下來出賣，連磚瓦、石料都不肯放過。”

外國軍隊撤離時，京城暫時處于無政府狀態，駐守西郊的散兵游勇、太監以及惡霸蜂擁闖進圓明園，再次劫掠院內陳設，大肆拆毀園內的殿堂、亭榭，盜運園內的磚瓦、木料等。其最甚者為本地土著的各旗營，曾經調駐城內，此時卻都逃出城來。他們手中操著斜五排快槍，回到家中化兵為匪，自由結合，聚眾大拆圓明園宮殿、砍伐樹木。只一個月時間，整個圓明園內的樹木及原來殘存之建筑蕩然無存。圓明園的西路毀于精捷營，北路毀于河北黃營，長春園毀于白旗大小營，其拆園最烈者為廂白旗小營與精捷營的八大惡棍首領。

守園太監與拆匪激烈槍戰

長春園中環形的“海岳開襟”原是建在湖中雙層漢白玉石園壇上的一座金碧輝煌、宏偉高大的建筑，由于船只被焚，無船可渡，在1860年英法聯軍之役幸免于難。光緒年間，慈禧還專門到此游幸，因此修葺一新，并由湖西岸上之“榴香渚”方亭至此添修長木板橋一道，橋側安裝紅色欄桿。由于八旗拆匪揚言要拆此處，該處太監首領楊四率領四名太監，園戶頭目周德海也率領園戶十名，日夜共同駐守。精捷營正白、正黃兩旗頭目揚言將于九月初七夜拆“海岳開襟”。于是楊四、周德海等人將木橋拆毀一段，堆積樹枝與沙袋，修成工事，又從熙春園請來六名槍手，幫助防守，其他太監與園役也架上大抬桿槍埋伏在沙袋后面。當天夜里，近百名旗民，攜帶斧鋸繩杠由西岸上木橋，發現橋被拆斷，八大匪首喊話，責令楊四、周德海搭上橋板，否則如攻上去難逃一死。周德海一聲令下，眾槍齊發，當場擊斃10余人，落水六七人，拆匪被迫退回西岸逃走。

至10月初，“海岳開襟”仍十分完整。后來，守方意見不一，又恐天寒結冰，無法防守，更怕敵方拆匪的報復，于是，守方人員紛紛辭職回原籍。此消息被廂白旗小營知道，該旗匪頭目，常作綁票勒贖的勾當，他們已從圓明園中掠到不少財物，現在知道周、楊二人撤出，便于10月14日率60名旗民，將“海岳開襟”全部占領，撬開大量陳設箱子，將珠寶奇珍一夜搶光。硬木桌椅一類的笨重之物，又搶運了三晝夜。最后將殿宇柱子鋸斷，用馬車運走可使用的木材，砍掉園內巨大的松樹和柏樹來賣錢。事實上，這種肆意的破壞讓圓明園內的殿堂樓閣完全消失，那些被偷來的木材，從柱子到窗框全都拿到附近的清河鎮，堆積成一座“小山”，等著變賣。即使從園內拿走的小木片和樹枝都可以在市集上找到，并被人當做燒火的木柴來使用。至此，一組水中樓閣建筑群，便只剩下廢墟。另外還有全部銅鑄品，也是在這時被洗劫的。

萬春園的西南角，有東廟和西廟，二廟相連。東廟為“敕建河神廟”，祭祀本園的河神，西廟為“惠濟祠”，祭祀運河龍神。兩廟前各有兩根旗桿，周圍有黃柏林木數百株。這兩座廟與大片柏林，在1860年之役中免于火劫，保存相當完整。事后，每年二月初九與八月初四春秋大祭，均由河工大臣與圓明園總管致祭。在這次庚子劫難中，旗民蜂擁而至準備拆除發財，他們甚至為“爭拆”發生沖突，進行了槍戰，雙方各死十余人。后經中人調停，改為合作共同拆售，售出之價由雙方平分。至此二廟與大片柏林均夷為平地。

萬春園中的“莊嚴法界”，也是英法聯軍毀園時的幸存者，其位置在“鑒碧亭”的北岸，入內正殿5間，東西配殿各3間，東邊還有“蔚藻堂”，為南向5間，建于太湖石的高臺上，也都在這次被毀。

清廷無力執掌圓明園

圓明三園被英法聯軍和八國聯軍破壞洗劫之后，一直還是作為皇家的禁園，由老太監守園看護。對圓明園一直念念不忘的慈禧太后，在她即將從西安返回北京的前夕，1901年8月28日在西安頒發了一道懿旨：命令正與各國公使談判的全權大臣奕匡，在議訂和約，將頤和園、圓明園一帶收回清廷后，要派得力官兵小心守護，“毋稍疏虞”。

但是，動亂后的巨額賠款進一步加重了清廷的財務壓力。1904年，清朝政府正式下令裁減圓明園部分官員，撤銷圓明園的總管機構，使圓明園陷入了無人管理的狀態。盡管圓明園到1909年時仍然有16718人之多，“但他們大部分是以前園戶的成員，包括婦女和孩童，而對圓明園來說，他們是破壞者而非保護者。

這一次動亂后，圓明園遭到了嚴重的破壞，園內一些地方已變成蘆葦連片，麥垅相望，如同田野一般，一些橋涵被破壞已部分不能度跨。除園墻、萬春園宮門、正覺寺等極少處圓明園遺址原真性的景區外，其余皆已失去了1860年英法聯軍火燒罪行的真實物證。到1911年，清政府為把廢園管理起來，決定將它附屬于頤和園，由清廷總管內務府大臣世續等進行管理。